Penetapan Kadar Hemoglobin

Hemoglobin merupakan protein yang terdapat dalam sel darah merah atau eritrosit, yang memberi warna merah pada darah. Hemoglobin terdiri atas zat besi yang merupakan pembawa oksigen. Kadar hemoglobin dapat ditetapkan dengan berbagai cara, antara lain metode Sahli, oksihemoglobin atau sianmethhemoglobin.

Metode Sahli tidak dianjurkan karena memiliki kesalahan yang besar, alatnya tidak dapat distandardisasi, dan tidak semua jenis hemoglobin dapat diukur, seperti sulfhemoglobin, methemoglobin dan karboksihemoglobin. Dua metode yang lain (oksihemoglobin dan sianmethemoglobin) dapat diterima dalam hemoglobinometri klinik. Namun, dari dua metode tersebut, metode sianmethemoglobin adalah metode yang dianjurkan oleh International Commitee for Standardization in Hematology (ICSH) sebab selain mudah dilakukan juga mempunyai standar yang stabil dan hampir semua hemoglobin dapat terukur, kecuali sulfhemoglobin.

Dasar Penetapan

Penetapan Hb metode Sahli didasarkan atas pembentukan hematin asam setelah darah ditambah dengan larutan HCl 0.1N kemudian diencerkan dengan aquadest. Pengukuran secara visual dengan mencocokkan warna larutan sampel dengan warna batang gelas standar. Metode ini memiliki kesalahan sebesar 10-15%, sehingga tidak dapat untuk menghitung indeks eritrosit.

Penetapan kadar Hb metode oksihemoglobin didasarkan atas pembentukan oksihemoglobin setelah sampel darah ditambah larutan Natrium karbonat 0.1% atau Ammonium hidroksida. Kadar Hb ditentukan dengan mengukur intensitas warna yang terbentuk secara spektrofotometri pada panjang gelombang 540 nm. Metode ini tidak dipengaruhi oleh kadar bilirubin tetapi standar oksihemoglobin tidak stabil.

Metode sianmethemoglin didasarkan pada pembentukan sianmethemoglobin yang intensitas warnanya diukur secara fotometri. Reagen yang digunakan adalah larutan Drabkin yang mengandung Kalium ferisianida (K3Fe[CN]6) dan kalium sianida (KCN). Ferisianida mengubah besi pada hemoglobin dari bentuk ferro ke bentuk ferri menjadi methemoglobin yang kemudian bereaksi dengan KCN membentuk pigmen yang stabil yaitu sianmethemoglobin. Intensitas warna yang terbentuk diukur secara fotometri pada panjang gelombang 540 nm.

Selain K3Fe[CN]6 dan KCN, larutan Drabkin juga mengandung kalium dihidrogen fosfat (KH2PO4) dan deterjen. Kalium dihidrogen fosfat berfungsi menstabilkan pH dimana rekasi dapat berlangsung sempurna pada saat yang tepat. Deterjen berfungsi mempercepat hemolisis darah serta mencegah kekeruhan yang terjadi oleh protein plasma.

Bahan Pemeriksaan

Bahan pemeriksaan yang digunakan untuk penetapan kadar hemoglobin (Hb) adalah darah kapiler atau darah EDTA.

Prosedur

Prosedur pemeriksaan yang akan dibicarakan di sini adalah prosedur yang menggunakan metode sianmethemoglobin. Ke dalam tabung reaksi dimasukkan 5 ml larutan Drabkin lalu ditambah 20 ul sampel darah. Lakukan pencampuran dengan cara membolak-balikkan tabung beberapa kali. Diamkan pada suhu kamar selama 3-5 menit kemudian ukur intensitas warna dengan fotometer pada panjang gelombang 540 nm dengan blanko reagen.

Kadar Hb dapat dibaca pada kurve kalibrasi atau dihitung dengan menggunakan faktor, dimana kadar Hb = serapan x faktor. Kurve kalibrasi dan faktor telah dipersiapkan sebelumnya.

Membuat Kurva Kalibrasi dan Perhitungan Faktor

Sebelum melakukan penetapan kadar Hb, fotometer harus dikalibrasi dulu atau dihitung faktornya. Untuk keperluan tersebut disiapkan larutan standar Hemisianida (sianmethemoglobin) dan pengenceran larutan tersebut dalam larutan Drabkin. Kadar Hb dari larutan standar dapat dihitung dengan rumus = kadar hemisianida x 0.251 g/dl

Buatlah pengenceran larutan standar 100, 75, 50, 25 dan 0 %, sebagai blanko dengan larutan Drabkin. Setelah semua tercampur, biarkan 3-5 menit pada suhu kamar lalu baca serapan (absorbance atau optical density/OD) pada fotometer dengan panjang gelombang 540 nm. Buatlah kurvenya dengan kadar Hb sebagai absis dan serapan sebagai ordinat. Selanjutnya untuk menetapkan kadar Hb pasien tinggal memplotkan pada kurve kalibrasi.

Jika memilih menggunakan perhitungan faktor, maka jumlahkan dulu nilai serapan (= total OD) dan kadar Hb larutan standar (= total kadar) yang telah diencerkan 100, 75, 50, 25 dan 0 %. Faktor (F) = total OD : total kadar

Kadar Hb pasien = OD pasien x F

Fotometer saat ini telah banyak yang dirancang untuk dapat menghitung secara otomatis dimana kadar Hb yang diukur sudah langsung diketahui tanpa kita harus melakukan penghitungan secara manual.

Nilai Rujukan

Dewasa pria : 13.2 - 17.3 g/dl

Perempuan : 11.7 - 15.5 g/dl

Bayi baru lahir : 15.2 - 23.6 g/dl

Anak usia 1-3 tahun : 10.8 - 12.8 g/dl

Anak usia 4-5 tahun : 10.7 - 14.7 g/dl

Anak usia 6-10 tahun : 10.8 - 15.6 g/dl

Masalah Klinis

Penurunan kadar : anemia (defisiensi besi, aplastik, hemolitik, dsb), perdarahan hebat, leukemia, kanker (usus besar, usus halus, rektum, hati, tulang, dsb), thalasemia, penyakit ginjal, penyakit Hodgkin, kehamilan, sarkoidosis, kelebihan cairan intra-vena. Pengaruh obat : antibiotik (kloramfenikol [chloromycetin], penisilin, tetrasiklin), aspirin, antineoplastik, doksapram (dopram), derivat hidantoin, vitamin A dosis besar, hidralazin (Apresoline), indometasin (Indocin), inhibitor MAO, primakuin, rifampin, sulfonamid, trimetadion (Tridione)

Peningkatan kadar : dehidrasi/hemokonsentrasi, polisitemia, daerah dataran tinggi, chronic heart failure (CHF), luka bakar yang parah. Pengaruh obat : gentamisin, metildopa (Aldomet)

Faktor Yang Mempengaruhi Temuan Laboratorium

Pengaruh obat (lihat keterangan di atas)

Mengambil darah pada tangan atau lengan yang terpasang cairan intra-vena menyebabkan darah terencerkan

Memasang turniket terlalu lama (lebih dari 1 menit) menyebabkan hemokonsentrasi

Tinggal di dataran tinggi menyebabkan peningkatan kadar Hb

Penurunan asupan atau kehilangan cairan akan meningkatkan kadar Hb akibat hemokonsentrasi, dan kelebihan asupan cairan akan mengurangi kadar Hb akibat hemodilusi